合作文章│Science Advances: 巨噬細胞中的Gasdermin D通過控制cGAS介導的炎癥來抑制結腸炎
英文標題：Gasdermin D in macrophages restrains colitisby controlling cGAS-mediated inflammation
中文標題：巨噬細胞中的Gasdermin D通過控制cGAS介導的炎癥來抑制結腸炎
發表期刊：Science子刊Science Advances
影響因子：12.804
技術手段：小鼠結腸組織LC-MS/MS cGAMP靶標定量
敏心生物協助南京醫科大學發表文章于Science子刊Science Advances
研究背景
炎癥性腸病（IBDs）是一種慢性的、復雜的疾病，其特征是腸道致病性炎癥失控和腸組織損傷。炎癥小體在黏膜免疫和結腸炎中的作用的潛在機制尚不清楚。一般認為炎癥相關蛋白以微生物群依賴的方式在實驗性結腸炎中發揮保護作用，但也有研究表明，有的炎癥小體在基線結腸內粘液層中可能不需要形成或具備功能。最近發現Gasdermin D（GSDMD）能夠在炎癥激活下游中發揮作用，造成細胞凋亡。GSDMD與感染性休克和實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）等疾病的潛在發病機制有關，但是GSDMD對結腸炎的作用的功能相關性和機制基礎尚不清楚。
研究方法
1、對小鼠進行急性實驗性結腸炎誘導。收集結腸進行免疫細胞和組織學等分析。
2、用ELISA法測定促炎細胞因子的產生，然后用RT-PCR進行擴增。
3、用ELISA試劑盒采集結腸勻漿上清液，測定cGAMP含量。
4、UPLC/MS分析：采用甲醇法提取樣品，然后進行LC/MS分析。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH Ami（100×2.1 m m，1.7μm）。
5、對結腸組織切片進行組織學分析和免疫熒光染色分析，以及對結腸上皮細胞和免疫細胞進行分離及FACS分析與分選。
6、將純化的巨噬細胞采用ELISA檢測細胞因子的產生，用RT-qPCR檢測細胞因子基因的表達。
7、進行16SrRNA基因測序RNA序列分析。
研究結果
GSDMD蛋白在小鼠的各種組織中高表達，特別是在腸系膜淋巴結（MLN）和腸道中（圖1A）。免疫熒光分析顯示GSDMD廣泛分布于LP-Cx3cr1+髓樣細胞和上皮E-cadherin+細胞（圖1B）。免疫印跡分析顯示結腸炎小鼠結腸中GSDMD和caspase-11的表達和裂解顯著增加（圖1C）。由結腸炎誘導的髓系細胞GSDMD活化主要表現為30kda的裂解片段，而p30和p47片段是IECs的主要裂解帶（圖1D）。這些結果表明GSDMD介導的細胞凋亡在結腸炎模型中的作用。
（ 圖1）
（A）免疫印跡法分析GSDMD-/-和野生型（WT）小鼠心臟、肝臟、腎臟、肺、mLNs、脾臟、小腸（SI）、結腸、皮質、中腦和小腦中GSDMD的表達；
（B）免疫熒光標記野生型小鼠結腸切片中GSDMD（紅色）、4′、6-二氨基-2-苯基吲哚（藍色）和Cx3cr1報告小鼠結腸切片中GSDMD（綠色）、Cx3cr1（紅色）和DAPI（藍色）；
（C）對照組或DSS處理的WT小鼠在第9天結腸中GSDMD和caspase-11的免疫印跡分析；
（D） DSS處理的WT小鼠第9天結腸IECs和骨髓細胞中GSDMD全長和裂解的免疫印跡分析。
GSDMD在DSS誘導的結腸炎中起保護作用，GSDMD的缺乏會加重DSS誘導的結腸炎，保護結腸巨噬細胞在結腸炎期間免于死亡。炎癥小體可以通過調節AMPs的產生來改變微生物的組成，從而避免結腸炎細菌的生長，GSDMD對AMPs和粘液的產生沒有影響，但對控制結腸炎癥是必不可少的。骨髓細胞中的GSDMD對DSS誘導的結腸炎的保護作用至關重要，巨噬細胞中GSDMD的功能對結腸炎的表型具有負性調節作用。GSDMD缺乏增強結腸炎時結腸巨噬細胞cGAS依賴性炎癥。
采用RNA測序分析DSS誘導結腸炎的發病階段（圖2A）。KEGG分析表明，GSDMD-CD11b+F4/80+細胞上調的最主要途徑之一是細胞溶質DNA感應途徑，其中細胞溶質DNA被cGAS感應并觸發炎癥反應（圖2B）。基因集富集分析（GSEA）和基因網絡分析進一步強調了GSDMD在調控DNA傳感途徑中的關鍵作用（圖2C和D）。與此一致，熱圖和RT-PCR分析顯示，許多與cGAS依賴性炎癥相關的基因在GSDMD-細胞中的表達顯著增加（圖2E和F）。然后在結腸炎期間測量了WT和GSDMD-/-結腸組織中的cGAMP濃度，并檢測到GSDMD-/-結腸組織中的cGAMP水平高于WTs（圖2G）。在DSS激發后，GSDMD-結腸組織中STING、TBK1和IRF3的磷酸化顯著增加。
（圖2）
（A）結腸巨噬細胞分類；
（B） KEGG分析WT和GSDMD-小鼠分離的結腸巨噬細胞中最顯著富集的信號通路；
（C）小鼠結腸巨噬細胞“胞漿DNA感應途徑”相關基因的GSEA；
（D）小鼠結腸巨噬細胞胞漿DNA傳感途徑相關基因的基因網絡分析；
（E）基因熱圖；
（F） RT-qPCR分析小鼠結腸巨噬細胞中的指示基因；
（G）WT和GSDMD小鼠結腸組織中cGAMP水平的UPLC/MS分析；
（H）免疫印跡分析
本研究提出了一個模型，結腸巨噬細胞中的GSDMD控制cGAS介導的炎癥，以應對粘膜屏障損傷后侵襲的腸道細菌或受損的腸上皮，從而防止結腸炎的發展（圖3）。因此，開發專門針對GSDMD-cGAS信號的診斷和治療策略可能有助于預防IBD。
（圖3）
DSS誘導的結腸炎GSDMD功能模型。結腸巨噬細胞中的GSDMD控制cGAS介導的炎癥反應，以應對粘膜屏障損傷后侵襲腸道細菌或受損腸上皮的DNA，從而防止結腸炎的發生。
總結
在本研究中，觀察到GSDMD蛋白在化學誘導結腸炎模型的腸道炎癥過程中被激活。GSDMD缺乏癥加重實驗性結腸炎不受微生物群變化的影響，也不影響抗菌肽的產生。GSDMD缺乏巨噬細胞，但不是上皮細胞，足以驅動這個惡化的實驗性結腸炎。并進一步證明了GSDMD在巨噬細胞中發揮負調控作用，控制環GMP-AMP合成酶(cGAS)依賴性炎癥，從而保護結腸炎。此外，使用cGAS抑制劑可以挽救gsdmd缺陷小鼠的大腸桿菌表型。總的來說，本文首次證明了GSDMD在控制結腸炎中的作用，并詳細描述了其潛在機制。
滬公網安備 31010702007149號